荧光蛋白质免疫印迹实验步骤（在牛奶中孵育一抗）

对于蛋白质印迹实验，在 4°C 下，将膜与稀释的抗体放在 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS、0.1% Tween-20 中孵育，轻轻搅动，过夜。

注：双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验，以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

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A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： ( #9808) 要配制 1L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
2. 1X SDS 样品缓冲液： （#7722、#7723）：62.5 mM Tris-HCl（在 25°C 下 pH 为 6.8）、2% w/v SDS、10% 甘油、50 mM DTT、0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
3. 转移缓冲液： 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
4. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： ( #9997) 要配制 1L 10X TBS：24.2 g Tris 碱、80 g NaCl；用 HCl（使用 1X）将 pH 调节至 7.6。
5. 脱脂乳粉： (#9999)（重量/体积 [w/v]）。
6. 封闭缓冲液：1X TBS、5% w/v 脱脂奶粉；要制备 150 ml，添加 15 ml 10X TBS 到 135 ml dH₂O 中，混匀。添加 7.5 g 脱脂乳粉，混匀。
7. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)。
8. 抗体稀释缓冲液： 1X TBS、0.1% Tween-20、5% 脱脂奶粉；要配制 20 ml，添加 2 ml 10X TBS 到 18 ml 水中，混匀。添加 1.0 g 脱脂乳粉，混匀。搅动时，加入 20 µl Tween-20 (100%)。
9. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format)： (#7720)。
10. 印迹膜： 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化（推荐）。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；使用冷的 1X PBS 洗涤细胞；吸取。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10–15 秒，完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 将 20 µl 样品加热至 95-100°C，时长 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 用微量离心机分离 5 分钟。
7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

注：建议将预染蛋白分子量标准品（#7720，10 µl/泳道）上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

8. 电转移至硝酸纤维素膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

注：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量。

1. （可选）转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
2. 膜在室温下用 25 ml 封闭缓冲液孵育 1 小时。
3. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。
4. 在 4°C 下，将膜和一抗（按产品数据表中建议的相应稀释度）放在 10 ml 抗体稀释缓冲液中孵育，轻轻搅动，过夜。
5. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。
6. 将膜与荧光素偶联的二抗（1 mg/ml 母液按 1:5000-1:25,000 稀释）放在 10 ml 抗体稀释缓冲液中室温孵育 1 小时，轻轻搅动。
7. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。

D. 蛋白质检测

1. 将膜上多余的 TBS/T 沥干，并让它干燥。
2. 请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。