流式细胞术实验步骤（流式）

重要事项：请参阅产品数据表首页或产品网页上的应用版块，以确定该产品是否已经验证且可用于流式细胞术 (F)。请参阅产品网页上的产品专用流式细胞术实验步骤，以了解相应的固定和通透条件以及建议的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
2. 16% 甲醛（无甲醇）。
3. 100% 甲醇（如果需要）。
4. 孵育缓冲液：在 100 ml 1 X PBS 中溶解0.5牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。4°C 保存。
5. 二抗：抗小鼠（#4408、#8890、#4410、#8887）、抗兔（#4412、#8889、#4414、#8885）、抗大鼠（#4416、#4418）

B. 固定

注：如果要进行活细胞染色，则继续进行免疫染色（D 部分）。请参阅产品网页和产品专用实验步骤，以确定产品是否可用于活细胞染色。

1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
2. 用 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4%。
3. 在室温下固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。

C. 透化

注：请参阅产品网页上的产品专用实验步骤，以了解正确的通透条件。并不是所有产品都可用甲醇通透处理。

1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
2. 在冰上孵育 30 分钟。
3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。
2. 如果需要，通过离心分离以及足够的 1X PBS 来洗涤细胞，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
3. 在 100 µl 稀释一抗（按照推荐的稀释比例在孵育缓冲液中配制）中重悬细胞。
4. 在室温下（固定细胞）孵育 1 小时或在冰上（活细胞）孵育 15-30 分钟。
5. 通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接标记的抗体，则跳到步骤 9。
6. 在 100 µl 稀释的荧光染料标记的二抗（按建议的稀释度在孵育缓冲液中配制）中重悬细胞。
7. 在室温下（固定细胞）或在冰上（活细胞）孵育 30 分钟。
8. 通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤。弃去上清液。重复。
9. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析；或者，如要进行 DNA 染色或活/死细胞识别，则继续进行可选的 DNA 染色（E 部分）。

E. 可选的 DNA 染料（固定细胞）或活/死细胞识别染料（活细胞）

1. 在 0.5 ml DNA 染料或活/死细胞识别染料（如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087）中重悬细胞。
2. 在室温下（固定细胞）或在冰上（活细胞）孵育 5 分钟。
3. 如果需要，在 PBS 中离心洗涤。在流式细胞分析仪上分析细胞。