ELISA-肽测定法实验步骤

A. 溶液与试剂

1. 碳酸盐缓冲液： 15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。将 1 μM 合成肽溶于碳酸盐缓冲液中。
2. 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 至 1 L dH₂O。调节 pH 至 7.4。
3. 洗涤缓冲液：含有 0.05% Tween 20 的 1 X PBS (PBST)
4. 封闭缓冲液：PBST 中 10 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)
5. 抗体稀释缓冲液： 3% BSA 稀释于 PBST 中
6. DELFIA 铕标记的针对小鼠一抗的 Anti-mouse IgG 或针对兔一抗的 Anti-rabbit IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124)。
7. DELFIA 增强溶液 (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

B. 实验步骤

1. 将 100μl 1 μM 稀释于碳酸盐缓冲液中的合成肽，加入 96 孔微量滴定板的各孔，在 4°C 孵育 过夜或37°C 孵育 2-6 小时进行包被。如果肽不结合或不吸附，可尝试pH在4–8 内的其他缓冲液。
2. 用 200 μl/孔的洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。
3. 用 200 μl/孔的封闭缓冲液在 37 °C 下封闭平板 1 小时。将洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。（如果需要，可以持续 1-2 个月将平板保持在 4°C ）
4. 用抗体稀释缓冲液配制适宜稀释度的一抗 。向每个孔中添加 100μl，并在 37°C 孵育 1 小时。
5. 用洗涤缓冲液洗涤 3 次。
6. 添加稀释于 100μl/孔抗体稀释缓冲液中的 67ng/孔 DELFIA 铕标记 Anti-mouse IgG。在 37°C 孵育 30 分钟。
7. 用洗涤缓冲液洗涤 5 次。
8. 添加 100μl 增强溶液并在 37°C 孵育 15 分钟。用适宜的时间分辨平板读数仪在 615 nm 读取平板读数。