下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有从 ChIP DNA 或 CUT&RUN DNA 生成高质量 DNA 测序文库供 Illumina 平台上进行下一代测序分析所需的所有酶和缓冲液。快速、人性化的工作流程可最大程度地缩短产生和纯化 DNA 库的亲自动手时间。
每种试剂盒组分都必须符合严苛的质量控制标准，并且对于每个新批次，都通过在 Illumina 测序平台上构建索引化文库并对其测序来功能性验证整套试剂。
本产品必须联合 Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 使用。本产品包含数量足以进行 24 次反应的试剂，并且兼容于酶解片段化或超声处理片段化、ChIP 富集的 DNA 和 CUT&RUN DNA 二者（针对富集自 ChIP 测定法或 CUT&RUN 测定法的 DNA 实验步骤不同）。
兼容的上游检测试剂盒：
- CUT&RUN Assay Kit #86652
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
- SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #56383
不兼容的上游检测试剂盒：
注：琼脂糖珠被超声处理的鲑鱼精子 DNA 封闭，这将污染 DNA 库制备和 NG-seq。
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
构建 DNA 库所需的其他产品：
- Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580
- 或
- Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
所需的试剂
包括的试剂：
- •（绿色）End Prep Enzyme Mix #73416
- •（绿色）End Prep Reaction Buffer #93209
- •（红色）Ligation Master Mix #46719
- •（红色）Ligation Enhancer #30147
- •（蓝色）Q5 PCR Master Mix (2X) #67488
未包括的试剂：
- Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
- Nuclease-free Water #12931
- AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
- 80% 乙醇（新鲜制备）
- 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）
- 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）
- 磁力架/支架
- Bioanalyzer 和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
- PCR 试管和 PCR 仪器
DNA Library Prep Kit for Illumina Protocol for ChIP DNA
对于使用 CUT&RUN DNA 制备 DNA 库，请继续实验步骤的 CUT&RUN 部分。
| 安全停止 |
如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
I. 结束制备
进行 ChIP-seq 时，必须生成一个对照 DNA 测序库，用于确定在 ChIP 分析和 DNA 库制备过程中引起的 DNA 富集是否有任何实验偏差。用输入染色质（即用于进行免疫沉淀的染色质）纯化的 DNA 通常用来生成对照 DNA 库。
所需材料： 500 pg –1 μg ChIP DNA。为确保 DNA 测序库的最佳多样性，我们建议在转录因子和辅助因子 ChIP-seq 中使用 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在总组蛋白或组蛋白修饰 ChIP-seq 中使用 50 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在对照 DNA 测序库中使用 50 ng 输入 DNA。如有必要，在库的生成中使用少于 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，但由于扩增过程中存在 PCR 偏差，这可能会导致库的多样性程度较低。
在开始之前：
- 在室温下解冻 End Prep Enzyme Mix (•)。
- 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。
- 用无菌、不含核酸酶的试管制备 0.5-50 ng ChIP DNA 和相对输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
- 往每份 DNA 样品中添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，使总反应体积为 60 μl。
- 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
- 放在热循环仪中，并进行以下流程：
- 在 20 °C 下保存 30 分钟
- 在 65 °C 下保存 30 分钟
- 保持在 4 °C 下
- 继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。
II. 接头蛋白连接
在开始之前：
- Adaptor for Illumina (•) 和 USER 酶 (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
- 在室温解冻 Adaptor for Illumina (•)。
- 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
- 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
- 将 Adaptor for Illumina (•) 在 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释。如果起始 DNA 为 5 ng 至 100 ng，则以 1:10 的比例稀释接头蛋白，以产生 1.5 mM 的使用浓度。如果起始 DNA 少于 5 ng，则以 1:25 的比例稀释接头蛋白，以产生 0.6 mM 的使用浓度。
- 将 30 μl Ligation Master Mix (•)、1 μl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina 直接加至 60 μl End Prep Reaction Mixture（源于第 I 部分的步骤 5）。
注：不建议提前制备含有稀释接头蛋白的反应预混物。
- 通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
- 在室温下孵育 15 分钟。
- 向连接混合物添加 3 μl USER Enzyme (•)。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
- 继续清除接头蛋白连接的 ChIP DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。
III. 清除接头蛋白连接的 ChIP DNA，无需进行大小选择。
在清除接头蛋白连接的 ChIP DNA 的阶段，不建议进行大小选择，因为它会导致 ChIP-seq DNA 库的产率和多样性急剧下降。
在开始之前：
- 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
- 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
- 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
- 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
- 向每个接头连接反应物添加 87 μl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
- 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
- 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
- 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
- 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
- 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
- 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
- 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
- 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。
IV. 对接头蛋白连接的 ChIP DNA 进行 PCR 富集
在开始之前：
- Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina (•) 和十二种 Index Primers for Illumina (•)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
- Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
- 在室温下解冻引物和纯化的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9）。
- 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
| 试剂 |
1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl) |
| 纯化后的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9） |
15 μl |
| Q5 PCR Master Mix (•) |
25 μl |
| Single Index Primer for Illumina (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina [橙色盖]） |
5 μl |
| Universal PCR Primer for Illumina (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 5 Primer for Illumina [白色盖]） |
5 μl |
- 通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。
- 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
| a. |
初始变性 |
98°C 30 秒 |
| b. |
变性 |
98°C 10 秒 |
| c. |
退火和延伸 |
65°C 15 秒 |
| d. |
如果起始原料为 50 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 6 次。
如果起始原料为 5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 10 次。
如果起始原料为 0.5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 13 次。
|
| e. |
终末延伸 |
65°C 3 分钟 |
| f. |
保持 |
4°C |
- 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。
V. 清除 PCR 扩增物
在开始之前：
- 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
- 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
- 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
- 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
- 向源于第四部分中步骤 4 的 50 μl PCR 反应添加 45 μl (0.9X) 重悬的 AMPure XP 珠 或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
- 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
- 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
- 小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
- 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
- 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
- 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。
- 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
- 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。
- 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
- 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
- 如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。
- 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina 测序手册，了解 NG-seq 所要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。
用于 CUT&RUN DNA 的 DNA Library Prep Kit for Illumina Protocol
| 安全停止 |
如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
I. 结束制备
进行 期间CUT&RUN-seq 时，需要生成一个对照 DNA 测序文库，该文库可以用于确定 DNA 富集过程中在 CUT&RUN 测定法和 DNA 文库制备期间引入的任何实验性偏差。从输入 DNA 中纯化的 DNA（参见 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤的第五部分）通常用于生成对照 DNA 库。
所需材料： 0.5 ng–1 μg CUT&RUN DNA。每个反应的 CUT&RUN DNA 的典型产率为 100,000 个起始细胞 0.6 至 6 ng 。为了确保 DNA 测序文库的最佳多样性，我们建议使用您可以从 CUT&RUN 反应所获得尽可能多的 CUT&RUN DNA。如有必要，少至 0.1 ng 的 CUT&RUN DNA可以用于文库生成；然而，这可能因扩增期间 PCR 偏差而导致文库多样性较低。对于使用输入 DNA 的对照 DNA 测序文库，5 - 10 ng 是一个良好起点。请注意，需要 Picogreen 测定法测定 CUT&RUN DNA 浓度，因为单用 Nanodrop 并不足够灵敏。
在开始之前：
- 在室温解冻 End Prep Reaction Buffer #93209 ( •)。如果 DTT 析出，则涡旋混合。
- 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。
- 在独立的无菌无核酸酶管中配制 0.5-10 ng CUT&RUN DNA 和相关性输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。
- 向每份 DNA 样品添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，以形成 60 μl 反应总体积 。
- 上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。
- 放在热循环仪中，并进行以下流程：
- 在 20 °C 下保存 30 分钟
- 在 50 °C 下保存 30 分钟
- 保持在 4 °C 下
- 继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。
II. 接头蛋白连接
在开始之前：
- Adaptor for Illumina ( •) 和 USER 酶 ( •) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。
- 在室温解冻 Adaptor for Illumina ( •)。
- 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。
- 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
- 在如表中所示的 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释 Adaptor for Illumina ( •)，以避免过多接头污染 DNA 文库。
| 起始 DNA |
适配体稀释 |
适配体工作浓度 |
| 100 ng – 1 μg |
无稀释 |
15 μM |
| 5 ng – 100 ng |
1:10 |
1.5 μM |
| 2.5 ng – 5 ng |
1:25 |
0.6 μM |
| 1.25 ng – 2.5 ng |
1:50 |
0.3 μM |
| 小于 1.25 ng |
1:125 |
0.12 μM |
- 将 30 μl Ligation Master Mix (•)、1 μl Ligation Enhancer (•) 和 2.5 μl 稀释的 Adaptor for Illumina 直接加至 60 μl End Prep Reaction Mixture（源于第 I 部分的步骤 5）。
注：不建议提前制备含有稀释接头蛋白的反应预混物。但是，如果在 4°C 放置 < 8 小时，则允许使用 Ligation Master Mix 和 Ligation Enhancer 的预混物。
- 通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。
- 在室温孵育至少 15 分钟。
- 向连接混合物添加 3 μl USER Enzyme ( •)。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。
- 继续清除适配体连接型 CUT&RUN DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。
III. 不进下行大小选择情况清除适配体连接型 CUT&RUN DNA。
在清除适配体连接型 CUT&RUN DNA 阶段期间不建议进行大小选择，因为这导致 DNA 文库产率和多样性骤降。
在开始之前：
- 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
- 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
- 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
- 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
- 向每个接头连接反应添加 106 μl (1.1X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
- 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
- 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
- 一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
- 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
- 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
- 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
- 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
- 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。
IV. PCR 富集适配体连接型 CUT&RUN DNA
在开始之前：
- Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina ( •) 和十二种 Index Primers for Illumina ( •)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
- Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina（白色盖）和十二种 Index 7 Primers for Illumina（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。
- 在室温解冻引物和纯化的适配体连接型 CUT&RUN DNA 片段（源于第三部分的步骤 9）。
- 将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：
| 试剂 |
1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl) |
| 纯化的接头蛋白连接型 CUT&RUN-DNA 片段（源于第三部分的步骤 9） |
15 μl |
| Q5 PCR Master Mix ( •) |
25 μl |
| Single Index Primer for Illumina ( •)（或用于双重索引化的 Dual Index 7 Primer for Illumina [橙色盖]） |
5 μl |
| Universal PCR Primer for Illumina (•)（或用于双重索引化的 Dual Index 5 Primer for Illumina [白色盖]） |
5 μl |
- 通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。
- 将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：
| a. |
初始变性 |
98°C，30 秒 |
| b. |
变性 |
98°C，10 秒 |
| c. |
退火和延伸 |
65°C，13 秒 |
| d. |
对于 50 - 100 ng 起始 CUT&RUN DNA |
重复步骤 b 和 c，总计 6 - 7 次循环。 |
| 对于 5 - 50 ng 起始 CUT&RUN DNA |
重复步骤 b 和 c，总计 8 - 12 次循环。 |
| 用于 1 - 5 ng 起始 CUT&RUN DNA |
重复步骤 b 和 c，总计 13 - 15 次循环。 |
| 用于 0.5 - 1 ng 起始 CUT&RUN DNA |
重复步骤 b 和 c，总计 16 - 17 次循环。 |
| 用于 0.2 – 0.5 ng 起始 CUT&RUN DNA |
重复步骤 b 和 c，总计 18 - 19 次循环。 |
| 用于 0.1-0.2 ng 起始 CUT&RUN DNA |
重复步骤 b 和 c，共循环 20 次 |
| e. |
终末延伸 |
65°C，3 分钟 |
| f. |
保持 |
4°C |
- 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。
V. 清除 PCR 扩增物
在开始之前：
- 如果使用 AMPure XP 珠，则让这些珠在使用前预热至室温至少 30 分钟。
- 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
- 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。
- 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。
- 向源于第四部分中步骤 4 配制的50 μl PCR 反应添加50 μl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。
- 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
- 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。
- 小心清除和丢弃上清液。小心移除所有液体残留物，但勿扰动含 DNA 靶标的珠子。
- 在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。
- 重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
- 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
- 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。
注：如果需要更高浓度的文库 DNA，可以使用更少体积的 Tris-HCl (pH 8.0-8.5)（例如 17 μl）。
- 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。
注：如果步骤 8 中使用 17 µl 的 Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，则仅转移 15 µl 含 DNA 靶标的上清液至新管。
- 通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。
- 使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，利用 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA 芯片，使用稀释的文库 DNA 确定大小分布。
- 如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。
- 使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina 测序手册，了解 NG-seq 所要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。
附录 A：试剂盒组分的质量控制
I. End Prep Enzyme Mix (•)
描述
End Prep Enzyme Mix 经优化后可将 500 pg-1 μg 碎裂的 DNA 转化为具有 5´-磷酸化、3´-dA 尾端的已修复 DNA。
质量控制检测
- SDS-PAGE 纯度：对每个单独的酶进行的 SDS-PAGE 分析显示，酶纯度 > 95%。
- 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 10 μl 这种酶混合物和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
- 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入至少 10 μl 这种酶混合物，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
- 功能活性（核苷酸掺入、磷酸化和 dA 拖尾）：在 1X End Repair Reaction 缓冲液中加入 1 μl 这种酶混合物，在 25°C 下孵育 20 分钟，经毛细管电泳确定，可修复和磷酸化 0.5 μg 含 3´ 和 5´ 突出端的 DNA 片段的 > 95% 末端。
II. End Prep Reaction Buffer (•)
质量控制检测
- 16 小时孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的反应缓冲液和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的反应缓冲液和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
- 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的反应缓冲液和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
- 核糖核酸酶活性：将 1X 浓度的反应缓冲液和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
- 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入 1X 浓度的反应缓冲液，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
III. Ligation Master Mix (•)
描述
Ligation Master Mix 是一种即用型解决方案，包含 T4 DNA 连接酶、专有连接增强子以及优化的反应缓冲液。
质量控制检测
- 16 小时孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
- 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
- 核糖核酸酶活性：将 1X 浓度的 Ligation Master Mix 和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
- 转化测定：将 LITMUS 28 载体用 EcoRV（平端）切割，用牛小肠磷酸酶处理并且进行凝胶纯化。使用 Ligation Master Mix 实验步骤，将 HaeIII 酶切 φX174 DNA 产生的钝性插入物以 3:1（插入物：载体）的比例连接在载体中。连接产物按之前所述转化。每一批均超过以下标准：
效率（转化物/µg）
| |
重新环化 |
插入 |
| 钝端 |
> 1 x 107 |
> 2.5 x 106 |
| 未切割的载体 |
> 1 x 108 |
N/A |
IV. Ligation Enhancer (•)
质量控制检测
- 16 小时孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1 μl NEBNext 5´ SR Adaptor 3 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也无可检测的非特异性核酸酶降解。
- 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋 DNA，并在 37°C 下孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II（带切口的分子）的转化率低于 10%。
- 核糖核酸酶活性：在 10 μl 反应体积中加入 1 μl Ligation Enhancer 和 40 ng RNA 转录物，并在 37°C 下孵育 16 小时，经凝胶电泳确定没有可检测的 RNA 降解。
- 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入 1 μl Ligation Enhancer，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。
V. Q5 PCR Master Mix (2X) (•)
描述
Q5 PCR Master Mix (2X) 针对稳健、高保真扩增下一代测序分析 (NGS) 文库专门优化，无论 GC 含量如何。主混合物的聚合酶组分 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 是一种新型的 DNA 耐热聚合酶，它具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，可融合至一个持续合成能力增强的 Sso7d 结构域。Q5 的错误率也超低（比 Taq DNA 聚合酶的错误率要低 100 倍以上，比强烈火球菌 (Pfu) DNA 聚合酶要低大约 12 倍）。主混合物的缓冲液组分经优化可用于实现可靠扩增，即便是含有 GC 富集的扩增子的情况，并且对各种用于典型 NGS 工作流程的珠子具有更高的适用性。这些功能使得 Q5 PCR Master Mix 理想用于 NGS 文库构建。这种便利的 2X 主混合物包含 dNTPs、Mg++ 以及专有缓冲液，并且仅需添加引物和 DNA 模板即可进行可靠扩增。内含热启动适配子，可方便进行室温反应设置。
质量控制检测
- 16 小时孵育：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 Q5 PCR Master Mix 和 1 μg HindIII 已消化 λ DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的非特异性核酸酶降解。如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 Q5 PCR Master Mix 和 1 μg T3 DNA 的 50μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的非特异性核酸酶降解。
- 磷酸酶活性：如通过 405 nm 处分光光度分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（pH 9.8 的 1 M 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl2）孵育 Q5 PCR Master Mix 4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。
- 功能活性（多重 PCR、微珠抑制）：在含 0.5 μM 4-plex 引物混合物和 1X Q5 PCR Master Mix 的 50 μl 反应中存在和不存在羧化磁珠时，对 20 ng 基因组 DNA 的 30 个循环 PCR 扩增在磁珠存在下产生了四种预期的扩增子且无扩增抑制作用。
