PathScan^® 夹心 ELISA 实验步骤（化学发光）

注：关于实验孵育温度，请参考产品专用数据表。这种化学发光 ELISA 在小体积微量平板中提供。每个微孔中仅需要 50 µl 样品或试剂。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 10 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混合。
2. 使用前，让全部微孔板条达到室温。
3. 用 dH₂O 中稀释 20 X 洗涤缓冲液（包含于每个 PathScan^®夹心 ELISA 试剂盒中），制备 1 X 洗涤缓冲液。

4. 1X 细胞裂解缓冲液：10 X Cell Lysis Buffer ( #9803)：为了制备 10 ml 1 X 细胞裂解缓冲液，添加 1 ml 10 X 细胞裂解缓冲液至 9 ml dH₂O，混合。PathScan^® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1 X：这种缓冲液如原样直接使用。两种缓冲液可以贮存在 4°C 以供短期使用（1–2 周）。

   推荐：使用之前即刻添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) ( #8553)。

   注：关于裂解缓冲液推荐，请参考产品专用数据表或网页。

5. 20X LumiGLO Reagent and 20X Peroxide：(#7003)。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
5. 在冰上超声处理裂解物。
6. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1,200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 通过低速离心（约 1,200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 ml 生长培养基收取的细胞可以用含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
4. 在冰上超声处理裂解物。
5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 检测程序

1. 当微孔板条达到室温后，掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封放置在储存袋中，并立即贮存在 4 °C 的环境中。
2. 细胞裂解物可以不稀释使用或用样品稀释液（在每个 PathScan^® 夹心 ELISA 试剂盒中供应，蓝色）稀释使用。每个试剂盒的独立数据表或产品网页中都提供了有关裂解物适宜稀释倍数和试剂盒分析结果的信息。
3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 50 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。在室温下孵育平板 2 小时。此外，也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
4. 温和取下胶带并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用 1 X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次每孔 150 µl。
   3. 每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上，拍击力度要足够大，这样才能清除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
   4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
5. 向每个孔中添加 50 µl 检测抗体（绿色）。用胶带密封并将平板在室温孵育 1 小时。
6. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
7. 向每个孔中添加 50 µl HRP-连接的二抗（红色）。用胶带密封并将平板在室温孵育 30 分钟。
8. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
9. 通过混合等份 2 X LumiGLO 试剂和 2 X 过氧化物，制备检测试剂工作液。
10. 向每个孔中添加 50 µl 检测试剂工作液。
11. 使用设定在 425 nm 的基于平板的光度计在添加底物后 1-10 分钟内测量相对发光单位 (RLU)。
    1. 在 10 分钟内读数时，可实现最佳信号强度。