免疫组织化学实验步骤（石蜡） - 针对产品：9319

针对： Tyrosinase (T311) Mouse mAb (IHC Specific) #9319

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
3. 去离子水 (dH₂O)
4. Hematoxylin（可选）
5. 洗涤缓冲液：
   1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)： 要制备 1 L，添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH₂O 中。添加 1 ml Tween-20，混匀。
   10X Tris Buffered Saline (TBS)： (#9997) 要制备 1 L，添加 24.2 g Trizma 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH₂O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
6. 抗体稀释剂： SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)
7. 抗原修复： TE：10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 值 9.0：要制备 1L，添加 1.21 g Trizma 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 0.372 g EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 到 950 ml dH₂O 中。调整 pH 值至 9.0，然后用 dH₂O 将最终溶液定容至1000 ml。
8. 3% 过氧化氢： 要制备，添加 10 ml 30% H₂O₂ 到 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液： TBST/5% normal goat serum (#5425)：往 5ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum。
10. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125)。
11. DAB 试剂或合适底物： 按照制造商的建议制备。

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

1. 将玻片放入 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) 中煮沸，随后在亚沸温度下煮 18 分钟。在实验台上冷却 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片 5 分钟。
5. 每块切片用 100-400 µl 封闭液室温封闭 1 小时。
6. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。在室温孵育 30分钟。
7. 让 SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125) 试剂平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 每块切片滴 1–2 滴 SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125)。在室温孵育 30分钟。
10. 清除 SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125)，切片用洗涤缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。
11. 每块切片添加 100-400 μl DAB 或合适底物，并密切监测染色。
12. 完成制备时，将玻片浸入 dH₂O 中。
13. 如有需要，按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
14. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
16. 封装盖玻片。