流式细胞术 BrdU 修饰实验步骤

针对： BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292

A. 溶液与试剂

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH₂O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4，使其容量达到 1 升。室温保存。
2. BrdU（5-溴-2′-脱氧尿苷）EMD biosciences (Cat. #203806)
3. 乙醇，无水变性，组织学级，100% 和 95%
4. 1.5M 盐酸
5. 孵育缓冲液： 将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在 100 mL 1X PBS 中。4°C 保存。

B. BrdU 掺入和样本制备

1. 在新鲜温热的培养基中加入 BrdU，直至最终浓度为 0.03 mg/mL。搁置在一边。
2. 通过离心分离从试管中采集约 5000 万个细胞，并吸干上清液。
3. 将 2 ml 含 BrdU 的培养基添加至细胞沉淀物中，涡旋振荡后在 37°C 下孵育 30 分钟。
4. 通过离心分离使细胞成团并吸干培养基。
5. 将 2 ml 冷却的 70% 乙醇添加至细胞沉淀物中并且混合均匀。
6. 室温下固定细胞 5 分钟。
7. 加入 2–3 ml PBS，并通过离心分离润洗三次。
8. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
9. 加入 2–3 ml PBS 后通过离心分离润洗两次。
10. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注：对于单克隆抗体，使用同型匹配的对照组；对于多克隆抗体，使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将 0.5-1 x 10⁶ 个细胞分装入每个试验管（以体积计）。
2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管，随后通过离心分离润洗。重复。
3. ​在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
5. 向测试管加入适当稀释度的非偶联的一抗（参阅抗体数据表了解合适的稀释度）。
6. 在室温下孵育一小时。
7. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
8. 在荧光染料偶联的二抗* 中重悬细胞，二抗按照建议的稀释度稀释在孵育缓冲液中。
9. 在室温孵育 30 分钟。
10. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
11. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞，并用流式细胞分析仪进行分析；或者继续步骤 D1 进行 DNA 染色。

D. 可选的 DNA 染色

1. 在 0.5 ml DNA 染料中重悬细胞（如 DRAQ5 #4084)。
2. 在室温下孵育至少 5 分钟。
3. 用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。

*推荐的二抗：

鼠抗

• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410