使用偶联的二抗进行胞外染色的流式细胞术实验步骤

A. 溶液与试剂

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH₂O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4，使其容量达到 1 升。室温保存。
2. 甲醛（无甲醇）。
3. 孵育缓冲液： 将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在 100mL 1X PBS 中。4°C 保存。

B. 固定

1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
2. 在 0.5-1 ml PBS 中短暂重悬细胞。添加甲醛，直至最终浓度为 2-4%。
3. 在 37°C 下固定 10 分钟。
4. 添加 5 ml PBS 并通过离心润洗。
5. 在 5 ml PBS 中重悬细胞。
6. 继续染色或将细胞储存在含有 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中（在 +4°C 下）。

C. 使用未标记的一抗或接合后的二抗进行染色

注：对于单克隆抗体，允许使用同型匹配的对照；对于多克隆抗体，允许使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将 0.5-1x10⁶ 细胞分装到每个测试管中（按容量）。
2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液到每支试管，随后通过离心润洗。重复。
3. 每个测试管用 100 μl 孵育缓冲液中重悬细胞。
4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
5. 按照适当的稀释度向测试管中加入一抗（参见抗体说明书了解合适的稀释度）。
6. 在室温下孵育 30-60 分钟。
7. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
8. 在荧光物质标记的二抗*中重悬细胞，并按照制造商建议在孵育缓冲液中稀释。
9. 在室温孵育 30 分钟。
10. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
11. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞，并用流式细胞术进行分析。

*推荐的二抗：

兔抗

• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

鼠抗

• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410

抗大鼠

• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4418