免疫组织化学实验步骤（石蜡） - 针对产品：3633

针对： ALK (D5F3) XP^® Rabbit mAb #3633

重要事项：参见产品数据表，了解相应的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
3. 去离子水 (dH₂O)
4. Hematoxylin（可选）
5. 洗涤缓冲液：
   • 1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)： 要制备 1 L，添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH₂O 中。添加 1 ml Tween-20，混匀。
   • 10X Tris Buffered Saline (TBS)： 要制备 1 L，添加 24.2 g Trizma 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH₂O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
6. 抗体稀释剂： SignalStain^® Antibody Diluent #8112
7. 抗原修复： EDTA：1 mM EDTA：要制备 1 L，添加 0.372 g EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 到 1 L dH₂O 中。调节 pH 至 8.0。
8. 3% 过氧化氢： 要制备，添加 10 ml 30% H₂O₂ 到 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液： TBST/5% normal goat serum (#5425)：往 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum (#5425)。
10. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
11. DAB 试剂或合适底物： 按照制造商的建议制备。

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

注：本流程描述了使用 Biocare Medical Decloaking Chamber 所建议的条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

1. 将切片放入250 ml 室温下的 1.0 mM EDTA (pH 8.0) 24 个切片夹内。
2. 将 500 ml dH₂O 倒入加压蒸煮器中。
3. 将切片夹放入加压蒸煮器，直至接触到隔热板。再将一个能放 24 个切片的切片夹放入有 250 ml 水和空白切片的加压蒸煮器中，这样也许有好处。
4. 密封蒸煮器室，并继续进行修复。以下为 Biocare Medical Decloaking Chamber 的设置。
   1. SP1 125°C 30 秒
   2. SP2 90°C 10 秒
5. 小心给设备开排放口，随后取下盖子并将切片放在实验台上冷却 10 分钟。
6. 用 dH₂O 冲洗切片。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片 5 分钟。
5. 每块切片用 100-400 µl 封闭液室温封闭 1 小时。
6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–300 µl 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
7. 让 SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) 试剂平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 每块切片滴 1–2 滴 SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)。在室温孵育 30 分钟。
10. 清除 SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) 溶液，切片用洗涤缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。
11. 每块切片添加 100-400 µl DAB 或合适底物，并密切监测染色。
12. 完成制备时，将玻片浸入 dH₂O 中。
13. 如有需要，按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
14. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
16. 封装盖玻片。