免疫荧光实验步骤 – 针对产品：2187

针对： Phospho-CENP-A (Ser7) Antibody #2187

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

• 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 至 1 L dH₂O。调节 pH 至 8.0。
• 甲醛（16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.，货号 18814），使用新鲜制剂，打开的小瓶避光保存在 4°C 下，用 PBS 稀释后使用。
• 孵育缓冲液（1X PBS / 5% 正常山羊血清 (#5425) / 0.3% Triton X-100）
  要制备 25 mL，添加 2.5 mL 10X PBS 到 22.5 mL dH₂O 中，混匀。加入 1.25 g BSA 并混匀。搅动时，加入 75 μL Triton X-100 (100%)。
• 荧光物质偶联的二抗（建议使用的二抗）
  注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。
• Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
   注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸干固定液，用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 样品用孵育缓冲液封闭 60 分钟。
2. 封闭时，按照孵育缓冲液数据表上所示的稀释比例制备一抗。
3. 吸干孵育溶液，使用稀释的一抗。
4. 4°C 温度下孵育过夜。
5. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
   注：如果使用与 Alexa Fluor^® 荧光物质直接偶联的一抗，则跳到步骤 C8。
6. 在用孵育缓冲液稀释的荧光素偶联的二抗*中，室温孵育样品 1-2 小时，避光。
7. 按照步骤 5，使用 PBS 漂洗。
8. 使用 Prolong Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
9. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

*推荐的二抗：

兔抗

• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414