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ELISA 实验步骤 - 针对产品：12856

针对： PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Chemiluminescent Readout) #12856

A. 制备细胞裂解物

  1. 解冻 1X Cell Lysis Buffer #7018，充分混匀。向 1X Cell Lysis Buffer 添加 Protease Inhibitor Cocktail (100X) #5871。裂解缓冲液保存在冰上。
  2. 去除培养基，细胞用冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 去除 PBS 并添加冰冷的 1X Cell Lysis Buffer。对于黏附细胞，每块平板（直径为 10cm）使用 0.5ml 1X Cell Lysis Buffer #7018。在冰上孵育 2 分钟。
  4. 将裂解物转移到微量离心管，并在 4°C 下以最大转速微量离心分离 2 分钟。
  5. 将上清液转移到新试管。上清液是细胞裂解物，可立即使用或按一次使用的等量样品保存在 -80°C 下。
  6. 在进行检测前，立即用 Array Diluent Buffer 将裂解物稀释至 0.2-1.0 mg/ml。放置在冰上。

B. 检测流程

  1. 使用前，将玻片和封闭缓冲液放在室温下。
  2. 用去离子水稀释 20X Array Wash Buffer 来制备 1X Array Wash Buffer。用 19 ml 去离子水稀释 1 ml 20X Array Wash Buffer。标记为 1X Array Wash Buffer。保存在室温下。

  3. 按照如下流程制备 1X Detection Antibody Cocktail：

    仅使用 1 块：用 1350 µl Array Diluent Buffer 稀释 150 µl 10X Detection Antibody Cocktail。

    使用 2 块：用 2700 µl Array Diluent Buffer 稀释 300 µl 10X Detection Antibody Cocktail。置于冰上。

  4. 用 Array Diluent Buffer 稀释 10X HRP-linked Streptavidin 来制备 1X HRP-linked Streptavidin。置于冰上。
  5. 将多孔垫片粘到玻片上（参见底部结果图）：
    1. 将多孔垫片朝下放在实验台上（硅胶层应朝上）。拆下保护性塑料膜。
    2. 小心地将玻片放在多孔垫片上面，并使硝化纤维垫朝下，同时将垫与垫片开口对齐。垂直定向玻片时，方向线应出现在左上角。

    3. 将金属夹插入垫片凹槽中，并将其旋转进入锁定位置。确保夹子与玻片上的方向线在同一侧。

      注：其中一个夹子在上棱处刻有一个小圆点，以帮助将垫放到位（参见玻片架照片）。

    4. 将夹子滑到位。
    5. 按照相同的方法将未标记的金属夹放到架子的另一侧，并将其滑到位。
    6. 组装芯片可立即使用。

  6. 向每孔添加 100 µl Array Blocking Buffer，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 15 分钟。

    注：检测期间，任何时候都不要让垫变干。

  7. 将液体轻弹进水槽或其他恰当的废物容器中，以倒出 Array Blocking Buffer。向每孔添加 50-75 µl 稀释的裂解物，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 2 小时（或在 4°C 下孵育过夜）。
  8. 将液体轻弹进水槽或其他恰当的废物容器中，以倒出孔内含物。向每孔添加 100 µl 1X Array Wash Buffer，并在定轨摇床上室温孵育 5 分钟。重复 3 次以上。轻轻倒出孔内容物。
  9. 向每孔添加 75 µl 1X Detection Antibody Cocktail，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 1 小时。
  10. 如步骤 8 中一样，用 100 µl 1X Array Wash Buffer 洗涤 4-5 分钟。
  11. 向每孔添加 75 µl 1X HRP-linked Streptavidin，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 30 分钟。
  12. 如步骤 8 中一样，用 100 µl 1X Array Wash Buffer 洗涤 4-5 分钟。
  13. 将金属夹底部拉离玻片中心，以移除多孔垫片，随后分开玻片和垫片。
  14. 将玻片朝上放在一个塑料盘中（最好是一个清洁的吸管端盒盖）。用 10 ml 1X Array Wash Buffer 稍微洗涤。

  15. 用前立即稀释并混合 LumiGLO 和过氧化物试剂（要制备 10 ml 1X 溶液，则混合 9 ml 去离子水与 0.5 ml 20X LumiGLO 和 0.5 ml 20X 过氧化物）。

    Kodak Biomax 膜使用者注意：对于某些靶标，这种 LumiGLO/过氧化物稀释可能需要极短的曝光时间（2-3 秒）。为使曝光时间（20-30 秒）更易控制，添加 20 ml 去离子水至 10 ml LumiGLO/过氧化物混合物中，以制备 3 倍稀释的化学发光液。

  16. 轻轻倒出 Array Wash Buffer 并用 LumiGLO/过氧化物试剂覆盖玻片。
  17. 将玻片转移到薄片保护套中，确保始终被 LumiGLO/过氧化物试剂覆盖（在玻片上面添加少量试剂）。

  18. 立即使用能够检测化学发光信号的数字显影系统捕捉玻片图像。如需要，使用在市场上可买到的芯片图像分析软件来定量印迹强度。或者，也可使用化学发光膜。通过对发光盒上面施加均匀且较轻的压力，让膜曝光 2-30 秒钟（勿拧紧发光板夹子），从而避免 LumiGLO/过氧化物试剂被挤出。使用自动膜显色剂让膜显色。

    注：如果使用两块玻片，则不建议在同一个胶片感光暗匣盒内同时让它们一起曝光。在这种情况下，将第二块玻片放在洗涤缓冲液中（步骤 12），而对第一块玻片则继续进行相关步骤 13-18。第一块玻片结束后，对第二块玻片加新稀释的 LumiGLO/过氧化物试剂继续进行相关步骤 13-18。

玻片架照片

发布​时间 2013 年 11 月

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