针对小鼠脾细胞 T 细胞中 FoxP3 的流式细胞术实验步骤

针对： FoxP3 (D6O8R) XP^® Rabbit mAb #12653

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

• 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
• 甲醛（无甲醇）。
• 2% 甲醛（在 PBS 中稀释的甲醛原液；在实验当天新鲜制备）。
• Triton X-100。
• 1X ACK Lysis Buffer：将 8.29 g NH₄C_l、1 g KHCO₃、37.2 mg EDTA 溶解在 1L 的总量中；将 pH 调节至 7.2–7.4。4°C 保存。
• 孵育缓冲液：将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9988) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。4°C 保存。

B. 固定

注：按照制造商的要求，应在固定/通透前对活细胞进行 CD4 和 CD25 抗体表面染色。

1. 使用 100 µm 尼龙网状细胞过滤器分离脾脏细胞，然后采集到冷却的 PBS 中。
2. 通过离心分离收集细胞，随后在 ACK Lysis Buffer 中重悬细胞 5 分钟。（红细胞裂解）。
3. 通过离心分离用孵育缓冲液洗涤。
4. 以每支测试管 5–10 x 10⁵ 个细胞/100 µl 孵育缓冲液的浓度重悬新鲜分离的鼠源脾脏细胞。
5. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
6. 在 500 µl 2% 甲醛中重悬细胞。
7. 在室温下固定 15 分钟。
8. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

C. 透化

1. 向细胞沉淀物添加 1ml 0.3% Triton X-100（在 PBS 中按体积分数计量）。
2. 涡旋振荡后室温静置 30 分钟。
3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

D. 免疫染色

1. 在 100 µl FoxP3 (D6O8R) XP^® Rabbit mAb #12653工作溶液中重悬细胞沉淀物（按 1:200 稀释的抗体储存在孵育缓冲液中）。
2. 室温孵育 1 小时。
3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
4. 如果使用荧光染料偶联的一抗，则在 350 µl 孵育缓冲液中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析；对于非偶联或生物素化的一抗，继续进行步骤 5。
5. 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞，并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
6. 室温孵育 30 分钟。
7. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
8. 在 350 μl 孵育缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
9. FoxP3 在可针对 CD25 建立的且对 CD4+ T 淋巴细胞设门的二维双参数散点图上描绘。