针对人外周血单核细胞 (PBMC) 中的 FoxP3 的流式细胞术实验步骤

针对：

• FoxP3 (D6O8C) Rabbit mAb #12632
• FoxP3 (D6O8R) XP^® Rabbit mAb #12653

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
2. 甲醛（无甲醇）。
3. 2% 甲醛（在 PBS 中稀释的甲醛原液；在实验当天新鲜制备）。
4. Triton X-100。
5. Ficoll-Paque。
6. 孵育缓冲液：将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。4°C 保存。

B. 固定

注：按照制造商的要求，应在固定/通透前对活细胞进行 CD4 和 CD25 抗体表面染色。

1. 按照制造商说明，通过聚蔗糖密度离心分离从全血中分离出 PBMCs。
2. 通过离心分离用孵育缓冲液洗涤 2 次。
3. 在孵育缓冲液中重悬细胞，并以 1 x 10⁶ 个细胞/100 µl/样品管的浓度分装细胞。
4. 按照制造商建议的容量或浓度向测试管添加 CD4 和 CD25 抗体，随后放在冰上孵育 30 分钟。
5. 添加 2 ml 孵育缓冲液后，通过离心分离进行洗涤。
6. 吸干上清液后在 500 μl 2% 甲醛中重悬细胞。
7. 在室温下固定 30 分钟。
8. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

C. 透化

1. 在 1 ml 0.1% Triton X-100（在 PBS 中按体积分数计量）中重悬细胞。
2. 在室温下静置 30 分钟。
3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

D. 免疫染色

1. 在 100 µl FoxP3 (D6O8C) XP^® Rabbit mAb #12632 工作液（在孵育缓冲液中按 1:200 的比例稀释的抗体母液）中重悬细胞沉淀物。
2. 室温孵育 1 小时。
3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
4. 如果使用荧光染料偶联的一抗，则在 500 µl 孵育缓冲液中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析；对于非偶联或生物素化的一抗，继续进行步骤 5。
5. 在荧光染料偶联的二抗或荧光染料偶联的亲和素中重悬细胞，二抗或亲和素按建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
6. 室温孵育 30 分钟。
7. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
8. 在 500 μl 孵育缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
9. FoxP3 在可针对 CD25 建立的且对 CD4+ T 淋巴细胞设门的二维双参数散点图上描绘。