下一代测序 (NG-seq) 是一种可在靶向切割和标签化 (CUT&Tag) 测定法下游用于辨识并定量靶标 DNA 遍及整个基因组富集情况的高通量方法。CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 试剂盒非常适合多重样品制备供 Illumina 系统平台上进行 NG-seq。这种试剂盒可以用于生成多达 96 个可合并入单个测序反应中的不同、条形码化 CUT&Tag DNA 文库。本产品兼容于借助 CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 生成的 CUT&Tag DNA 样品以及来自其他标签化测定法（例如 ATAC-seq）的 DNA 样品。本产品不兼容来自 SimpleChIP® Chromatin IP Kits（#9003、#9005、#56383）的 ChIP-DNA 或来自 CUT&RUN Assay Kit (#86652) 的 CUT&RUN DNA 。
兼容的试剂：
不兼容的检测试剂盒：
所需的试剂
包括的试剂：
未包括的试剂：
| 安全停止 | 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
双索引引物策略利用每个引物内的两个 8 碱基索引。Index 7 引物包含 P7 序列周围的索引，而 index 5 引物则包含 P5 序列周围的索引。对序列待测的样品的两端添加特殊索引，即可实现双索引。将 12 index 7 引物的一端与 8 index 5 引物的一端结合在一起，便可为多达 96 种不同样品建立特殊索引。
Illumina NG-seq 系统使用红色激光/LED 给 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 给 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。如果未保持色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：
| GOOD | |||
|---|---|---|---|
| CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems | ||
| 索引 701 |
ATTACTCG |
索引 503 |
CCTATCCT |
| 索引 702 |
TCCGGAGA |
索引 504 |
GGCTCTGA |
| 索引 703 |
CGCTCATT |
索引 505 |
AGGCGAAG |
| 索引 704 |
GAGATTCC |
索引 506 |
TAATCTTA |
| ✔✔✔✔✔✔✔✔ | ✔✔✔✔✔✔✔✔ | ||
| BAD | ||||
|---|---|---|---|---|
| CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems | |||
| 索引 701 |
ATTACTCG |
索引 502 |
ATAGAGGC |
|
| 索引 702 |
TCCGGAGA |
索引 504 |
GGCTCTGA |
|
| 索引 703 |
CGCTCATT |
索引 506 |
TAATCTTA |
|
| 索引 704 |
GAGATTCC |
索引 508 |
GTACTGAC |
|
| ✔✔✔✔✔✔✔✔ | ✔✔✘✔✔✘✔✘ | |||
以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：
| Plex | CUT&Tag Index 7 primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems |
| 2 | Index 701 和 Index 702 Index 703 和 Index 704 Index 705 和 Index 706 Index 707 和 Index 708 Index 709 和 Index 710 Index 711 和 Index 712 |
任何 Index 5 引物 |
| 3 | Index 701、Index 702 和 Index 703 Index 703、Index 704 和 Index 705 Index 705、Index 706 和 Index 707 Index 707、Index 708 和 Index 709 Index 709、Index 710 和 Index 711 |
任何 Index 5 引物 |
| 4 | Index 701、Index 702、Index 703 和 Index 704 Index 703、Index 704、Index 705 和 Index 706 Index 705、Index 706、Index 707 和 Index 708 Index 707、Index 708、Index 709 和 Index 710 Index 709、Index 710、Index 711 和 Index 712 |
任何 Index 5 引物 |
| 5-12 | 与任何其他 i7 引物组合的任何有效 Index 7 4-plex （根据需要） | 任何 Index 5 引物 |
| > 12 | 与任何其他 i7 引物组合的任何有效 Index 7 4-plex （根据需要） | Index 501、Index 502 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 503、Index 504 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 505、Index 506 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 507、Index 508 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） |
另一些其他有效组合如下文所列。选择一组有效的 CUT&Tag Index 7 引物和一组有效的 CUT&Tag Index 5 引物。将每个 CUT&Tag Index 7 引物配合每个 CUT&Tag Index 5 引物一同使用，以形成所需数目的引物对用于 PCR 扩增所需数目的 DNA 文库 。
| 12 样品池 | (1) 一组 4 个 Index 7 引物 * 一组 3 个 Index 5 引物 (2) 一组 3 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 (3) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 2 个 Index 5 引物 |
| 26 样品池 | (1) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 加上任何 Index 7 引物和任何其他两个 Index 5 引物（组 4 除外） (2) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 5 个 Index 5 引物 使用 30 个引物对中的 26 个来扩增 26 个文库 |
每份 CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina systems 以 30 µl 量提供。
| 产品 | 索引引物序列 | 预期的索引引物序列读段 |
| ICUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TATAGCCT |
| ICUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
ATAGAGGC |
| ICUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CCTATCCT |
| ICUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GGCTCTGA |
| ICUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
AGGCGAAG |
| ICUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TAATCTTA |
| ICUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CAGGACGT |
| ICUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GTACTGAC |
其中 -s- 表示硫代磷酸键。
每份 CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina systems 以 20 µl 量提供。
| 产品 | 索引引物序列 | 预期的索引引物序列读段 |
| ICUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTACTCG |
| ICUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGGAGA |
| ICUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGCTCATT |
| ICUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAGATTCC |
| ICUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTCAGAA |
| ICUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAATTCGT |
| ICUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CTGAAGCT |
| ICUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TAATGCGC |
| ICUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGGCTATG |
| ICUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGCGAA |
| ICUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCTCGCGC |
| ICUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
AGCGATAG |
其中 -s- 表示硫代磷酸键。
注：更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。如果从少于 30 µl 的 CUT&Tag DNA 开始，则加入无 DNA 酶水以补足使体积至 30 µl。
| 试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (70 μl) |
|---|---|
| CUT&Tag DNA（或任何标签化 DNA） | 30 μl |
| CUT&Tag PCR Master Mix | 35 μl |
| CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina Systems (10 µM) | 2.5 μl |
| CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina Systems (10 µM) | 2.5 μl |
| a. | 缺口填充 | 58°C，5 分钟 |
| b. | 缺口填充延伸 | 72°C，5 分钟 |
| c. | 初始变性 | 98°C，30 秒 |
| d. | 变性 | 98°C，10 秒 |
| e. | 退火和延伸 | 60°C，11 秒钟 |
| 对于每个 CUT&Tag 反应介于 20,000 个与 100,000 个之间的细胞，重复步骤 d 和 e，共 13 个循环。 | ||
| 对于每个 CUT&Tag 反应的 20,000 个以及以下细胞，重复步骤 d 和 e，共 14-16 个循环。 | ||
| 注： 过多的 PCR 循环导致文库多样性较低和/或 NGS 读出序列重复率较高。 | ||
| f. | 终末延伸 | 72°C，1 分钟 |
| g. | 保持 | 4°C |
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
注：虽然针对组蛋白修饰生成的 CUT&Tag DNA 文库通常在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时显示出较多信号，但对于非组蛋白（例如转录因子和辅因子）生成的文库往往在使用 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统时具有非常弱的信号或甚至无可见信号，但仍然生成定位率高、可确定结合峰数目高和跨整个基因组信噪比可接受的 NGS 结果。因此，我们建议对来自转录因子和辅因子 CUT&Tag 反应中在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时不显示信号的 DNA 文库制备物测序。
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果珠子开始皲裂，则珠子太干。
注：已扩增的 CUT&Tag DNA 文库的产量可能因所使用的 DNA 定量方法而异。如果使用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统，组蛋白靶标的预期读数为 10-20 ng/μl，非组蛋白靶标的预期读数为 5-12 ng/µl。如果 Nanodrop 或 QIAxpert 系统的文库浓度低于 3 ng/µl，请在对样品进行测序之前参阅疑难解答指南。如果使用 Qubit 荧光定量系统或 Picogreen 检测法，组蛋白靶标的预期读数为 3-10 ng/μl，非组蛋白靶标的预期读数可能低于 1 ng/µl。
注：虽然针对组蛋白修饰生成的 CUT&Tag DNA 文库通常在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时显示出较多信号，但对于非组蛋白（例如转录因子和辅因子）生成的文库往往在使用 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统时具有非常弱的信号或甚至无可见信号，但仍然生成定位率高、可确定结合峰数目高和跨整个基因组信噪比可接受的 NGS 结果。因此，我们建议对来自转录因子和辅因子 CUT&Tag 反应中在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时不显示信号的 DNA 文库制备物测序。
注：通常，来自组蛋白靶标的 CUT&Tag DNA 文库j的浓度高于来自非组蛋白靶标的 DNA 文库。我们使用以下公式将文库浓度从 ng/μL 转换为 nM，然后将每个文库样品稀释至相同浓度 (nM) 旨在汇集：浓度（nM） = 1,000,000 X 浓度（ng/μL）/文库平均大小（bp）/660。对于 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统不能识别文库平均大小的 CUT&Tag 文库，我们建议使用 900 bp 的大小有意汇集比正常产率文库更多的低产率文库。此外，我们还建议合并这类文库，它们将具有比 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统上显示正常大小峰的文库多 5-10 倍的平坦信号。这确保读段数目在所有样品之间均匀分布。通常，文库汇集浓度 2 nM DNA 足以用于 NGS 目的，但总是欢迎更高浓度 。