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染色质免疫沉淀法实验步骤疑难排解指南

A. 预期的染色质产率

从组织样品收获交联的染色质时，组织类型之间的染色质产率可能显著不同。下表提供了根据实验步骤第四部分测定的 25 mg 组织或 4x 106 个 HeLa 细胞的预期染色质总产率以及预期的 DNA 浓度范围。

  • 在 SimpleChIP® Enzymatic 实验步骤中，使用 BD Medimachine 系统 (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器进行分离而产生的染色质数量相似。但与使用 Dounce 匀浆器进行的分离相比，使用 Mediamachine 进行组织分离通常可产生较高的免疫沉淀效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织，原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。
  • 在 SimpleChIP® Sonication 实验步骤中，建议对所有组织类型使用 Dounce 匀浆器。

为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 交联和碎裂的染色质，因此，对于某些组织，每次免疫沉淀可能需要收集超过 25 mg。

SimpleChIP® Kit 酶法 超声处理
组织 / 细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度 染色质总产率 预期 DNA 浓度
组织 / 细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度 染色质总产率 预期 DNA 浓度
脾 20–30 µg/25 mg 组织 200-300 μg/ml NT NT
肝 10–15 µg/25 mg 组织 100-150 μg/ml 10–15 µg/25 mg 组织 100-150 μg/ml
肾 8–10 µg/25 mg 组织 80-100 μg/ml NT NT
脑 2–5 µg/25 mg 组织 20-50 μg/ml 2-5 μg/
25 mg 组织		 20-50 μg/ml
心脏 2–5 µg/25 mg 组织 20-50 μg/ml 1.5–2.5 µg/25 mg 组织 15-25 μg/ml
Hela 10–15 µg /4 x 106 个细胞 100-150 μg/ml 10–15 µg /4 x 106 个细胞 100-150 μg/ml

NT = 未检测

B. 染色质碎裂优化

在 SimpleChIP® Enzymatic 实验步骤中，将交联染色质 DNA 消化成 150-900 bp 片段的最佳条件高度取决于消化中所使用的 micrococcal nuclease 与组织数量或细胞数的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。

    1. 按照实验步骤第一、二和三部分的说明，用 125 mg 组织或 2 x 107 个细胞（等同于 5 份免疫沉淀制备物）来制备交联胞核。在实验步骤第三部分的步骤 2 之后停止，并按照下面所述方法进行。
    2. 将 100 μl 胞核样品转移入 5 支单独的 1.5 ml 微量离心管并置于冰上。
    3. 添加 3 μl micrococcal nuclease 母液到 27 μl 1X Buffer B + DTT（酶稀释度 1:10）。
    4. 向步骤 2 的 5 根试管中的每根试管添加 0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl 或 10 μl 稀释的 micrococcal nuclease，多次倒转试管来混合，并且在 37°C 下孵育 20 分钟，同时频繁混合。
    5. 通过添加 10 μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上，终止每个消化。
    6. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 13,000 转/分钟离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
    7. 在 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬胞核沉淀物。在冰上孵育 10 分钟。
    8. 用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜。脉冲间隔将样品置于湿冰上孵育 30 秒。在超声处理前后用光学显微镜观察胞核，以确定胞核彻底裂解所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100Ultrasonic Homogenizer/Sonicator 设备，HeLa 胞核在 3 组 20 秒的脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
    9. 通过在微量离心机中在 4℃ 下以 10,000 转/分钟离心 10 分钟，使裂解物变得澄清。
    10. 从每份经超声处理的裂解物中取出 50 μl 并将其转移至新的微量离心管。
    11. 向每份 50 μl 样品，添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。摇晃混匀并在 37℃ 下孵育 30 分钟。
    12. 在每份经 RNA 酶 A 消化的样品中，添加 2 μl Proteinase K，涡旋混合并且在 65°C 下孵育样品 2 小时。
    13. 从每份样品中取出 20 μl，将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。
    14. 观察哪种消化条件能产生所需范围为 150-900 个碱基对（1-6 个核小体）的 DNA。使用该优化实验步骤时，产生所需 DNA 片段大小的已稀释 micrococcal nuclease 的体积相当于应添加至一份免疫沉淀制备物（25 mg 分离的组织细胞或 4 x 106个组织培养细胞）以产生所需 DNA 片段大小的 micrococcal nuclease 母液体积的 10 倍。例如，在本实验步骤中，如果 5 μl 稀释的 micrococcal nuclease 可产生 150-900 bp 的 DNA 片段，则在第三部分的染色质消化期间，应向一份免疫沉淀制备物添加 0.5 μl micrococcal nuclease 母液。
    15. 如果结果表明 DNA 不在所需大小的范围内，则重复优化实验步骤，相应地调整每次消化中 micrococcal nuclease 的数量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

    在 SimpleChIP® 超声处理实验步骤中，交联染色质 DNA 碎裂的最佳条件高度取决于所使用的细胞数、样品体积、超声处理时长以及超声波仪功率设置。对于每份超声处理样品，我们建议每 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer 使用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞。以下是确定某种特定组织或细胞类型的最佳超声处理条件的实验步骤。在 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬胞核沉淀物。在冰上孵育 10 分钟。

    1. 按照第一、二和三部分的说明，用 100-150 mg 组织或 1 x 107-2 x 107 个细胞制备交联胞核。在第三部分的步骤 4 之后停止，并如下所述继续。
    2. 通过超声处理碎片化染色质对于指定超声波仪，可以通过在规定功率设置（参见第 三 部分的步骤 5，以了解使用 Branson Digital Sonifier 250 探头超声波仪的最佳功率设置）下改变超声处理循环次数或时长来确定最佳超声处理条件。要确定最佳超声处理条件，设计一项超声处理时程实验，并在某个给定超声处理循环或时长后取出 50 µl 染色质样品。例如，每 1-2 分钟超声处理后取出染色质样品。
    3. 在 4°C 下用微量离心机以 21,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟，以让染色质样品变澄清。
    4. 将上清液转移到新的微量离心管中，并添加 100 µl nuclease-free water、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
    5. 在每份经 RNA 酶 A 消化的样品中，添加 2 μl Proteinase K #10012。涡旋混合并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
    6. 从每份样品中取出 20 μl，将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。
    7. 选择能产生最佳 DNA 片段大小的超声处理条件（参见下文注释），并用于第三部分步骤 5 中的染色质制备。如果未达到最佳超声处理条件，则增加或减少超声波仪的功率设置，并重复超声处理时程。

    注： 最佳超声处理条件根据样品类型和固定时间而不同。使用产生所需长度染色质片段需要的最少超声处理循环次数。超过 80% 短于 500 bp 的 DNA 总片段即视为过度超声处理，它会导致染色质过度受损，并降低免疫沉淀效率。

    • 要对固定 10 分钟的细胞进行超声处理，最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾，其中含有约 90% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。延长固定时间至 30 分钟会减少碎裂，从而产生 DNA 拖尾，其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。
    • 对固定 10 分钟的组织进行超声处理时，最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾，其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。延长固定时间至 30 分钟会减少碎裂，从而产生 DNA 拖尾，其中含有约 30% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。

    C. 疑难排解表

    问题 可能的原因 建议
    问题 可能的原因 建议
    1. 碎裂染色质的浓度过低。 染色质制备使用的细胞或组织不够，或细胞/组织裂解不完全。 如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 添加额外的染色质，以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。
    交联前，对单独平板上的细胞进行计数，以确定准确的细胞数量。
    酶法： 在超声处理前后，用显微镜观察细胞胞核，以确认胞核是否完全裂解。
    2. 染色质碎裂不足，且片段过大。染色质片段较大会导致背景增强和分辨率降低。 细胞可能过度交联和/或处理了过多的输入材料（细胞/组织）。 将交联时间缩短在 10-30 分钟范围内和/或减少每次超声处理所用的细胞/组织数量。
    酶法： 在染色质消化中增加 micrococcal nuclease 的数量或进行酶消化时程控制。
    超声处理： 进行超声处理时程控制。
    3. 染色质过度碎裂。在 PCR 定量期间，将染色质消化成单核小体长度的 DNA 可能会减弱信号，尤其是长度大于 150 bp 的扩增子。染色质过度超声处理可能会破坏染色质的完整性，并使抗体表位变性。 酶法： 添加用于消化的细胞不够或 micrococcal nuclease 过多。 酶法： 交联前，对组织称重或对单独的细胞板计数，以测定准确的细胞数。添加了更多的组织或细胞，或更少的微球菌核酸酶用于染色质消化。
    超声处理： 条件过于苛刻。 超声处理： 进行超声处理时程控制，以找到进行适当超声处理的最小输出/时长。
    4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。 添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。使用来源于交联和碎裂染色质的纯化 DNA 来优化针对实验用引物组的 PCR 条件。
    PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。 设计一个不同的引物组，并将扩增子的长度缩减到不到 150 bp。
    添加用于免疫沉淀的染色质不足，或染色质被过度碎裂。 为获得最佳的 ChIP 结果，每次免疫沉淀添加 5–10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。
    5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。 添加至 IP 反应的染色质或抗体不足，或者 IP 孵育时间过短。 确保每次免疫沉淀反应添加 5-10 µg 染色质和 10 µl 抗体，并用抗体孵育过夜，添加蛋白 G 微珠之后再孵育 2 小时。
    蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。 在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳，同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。
    6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。 添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者，添加至 IP 反应的抗体过多。 向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。将每次 IP 的 Normal Rabbit IgG 的量缩减至 1 µl。
    添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。 向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。要进行精确定量，在 PCR 的线性放大阶段分析 PCR 产物非常关键。
    7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。 添加至 PCR 反应的 DNA 不足。 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。
    添加至 IP 反应的抗体不足。 通常，免疫沉淀反应需添加 1–5 µg 抗体；但实际数量在很大程度上取决于具体抗体。增加添加至 IP 反应的抗体量。
    抗体不适用于 IP。 选择一种备选的经 ChIP 验证的抗体。

    发布​时间 2008 年 3 月

    修订时间 2017 年 5 月

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