多重 IHC

我们广泛的验证和先进技术支持可确保我们所有经 IHC-P 验证的抗体都可用于荧光多重 IHC。

多重 IHC 的优势

对每块组织切片收集最多的数据，这在组织样品有限时非常关键。
了解保留组织结构内多个靶标的共表达和空间结构，有别于备选多重方法（如：下一代测序、PCR、质谱法等）。

FFPE 扁桃体上的 PD-L2（橙色）、PD-L1 (E1L3N^®)（红色）、CD68（绿色）、PD-1（黄色）、CD8α（品红色）和 Pan-Keratin（蓝绿色）。

能够同时观察多个靶标在肿瘤免疫学等研究领域中非常重要，在肿瘤免疫学中，有必要将肿瘤微环境中的免疫细胞和癌细胞亚群编入目录。例如，肿瘤细胞可能会通过控制免疫检查点蛋白（如：PD-1、CTLA-4、TIM-3）的表达来逃避免疫检测，从而“避开”激活的 T 细胞。或者，T 细胞在摧毁肿瘤细胞方面不太有效，因为它们会发生耗竭，这是一种以免疫检查点蛋白表达、VISTA T 细胞表达改变以及出现 CD68+ 共浸润巨噬细胞为特征的现象。因此，了解复杂肿瘤微环境以及开发针对性合并治疗干预措施的关键在于：免疫检查点蛋白的分子表达谱以及免疫细胞表型分析。

多重选择

以酪胺为基础的多重技术的优势：

信号扩增：
- 提供显著增强的抗原相关荧光信号。
- 能够检测低富集度的靶标。
简化小图设计：适合任何经 IHC-P 验证的抗体，无论是宿主还是同种型抗体。

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使用酪胺进行荧光 mIHC：概述

酪胺是一种有机酚，在添加催化剂 (HRP) 的情况下，它会被激活并共价结合富含电子的区域，这些区域通常是在蛋白抗原表面或附近的酪氨酸残基（见下面的示意图）。因此，HRP 催化酪胺-荧光基团分子沉淀，会使抗原位点处的荧光信号增强扩增。

酪胺-酪氨酸结合的共价性质可通过热介导清除（剥离）与抗原结合的一抗/二抗对，同时保留与抗原相关的荧光信号。这可促进连续使用相同宿主或同种型的多种一抗，而无需担心会发生交互作用，从而大大提高多重技术潜能。

成功的条件

以酪胺为基础的荧光 mIHC 需要满足以下因素：

建议用于 IHC-P 的、经严格验证且高度特异性的一抗 (Ab)。
注：CST 提供的所有经 IHC-P 验证的 Ab 都可用于荧光 mIHC。
二抗对一抗的宿主/同种型具有特异性，且偶联 HRP，HRP 是一种可催化酪胺激活和永久沉淀的酶。
注：也可使用直接偶联 HRP 的一抗。
酪胺-荧光基团偶联物。
用于超过 3 个靶标的 mIHC 小图的多谱段相机以及一种胞核复染剂。

多谱段显影与传统显影

抗体小图的大小在很大程度上决定了选择的显影系统。

较小小图尺寸（1-3 靶标/荧光基团）；在低重环境下，传统摄影机更能为每个靶标提供更高的分辨率。参见使用多谱段相机和传统相机所拍的宽场图像的比较。

PD-L1、CD3ε、CD8α Multiplex IHC Panel #65713：使用 PD-L1 (E1L3N^®) XP^® Rabbit mAb #13684（绿色）、CD3ε (D7A6E) XP^® Rabbit mAb #85061（黄色）和 CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific) #70306（红色），对石蜡包埋的人乳腺癌组织进行三重荧光 mIHC 分析。蓝色伪彩 = DAPI #8961（DNA 荧光染料）。

较大的小图尺寸（> 4 靶标/荧光基团）则需使用多谱段相机。多谱段显影系统支持能够线性分离具有重叠激发/发射光谱的荧光基团（和色素原）的软件，因此能够以较高的分辨率促进多重靶标检测。在进行共表达分析时，这一点尤为关键。

注：组织自发荧光是一个通常会导致荧光 IHC 敏感性较低的问题。在所有荧光显影平台环境下，这种现象较为明显。多谱段分析软件可以解决这个问题，它能消减源于未染色组织的人造荧光信号。