使用酪胺信号扩增实验步骤的荧光多重免疫组织化学 (mIHC) 实验

A. 溶液、试剂和试剂盒

1. 二甲苯。
2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 抗原修复液：

   1. 柠檬酸： 10 mM 柠檬酸钠 (pH 6.0)

      要配制 500 ml 1X Citrate Unmasking Solution：添加 50 ml SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) #14746 到 450 ml dH₂O 中。

   2. EDTA： 1 mM EDTA (pH 8.0)

      要配制 500 ml 1X EDTA Unmasking Solution：添加 50 ml SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747 到 450 ml dH₂O 中。

5. 3% 过氧化氢
   1. 要配制 500 ml 3% H₂O₂：添加 50 ml 30% H₂O₂ 到 450 ml dH₂O 中。
6. SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)。
7. 洗涤缓冲液：1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)
   1. 要配制 1L 1X TBST：添加 100 ml 10X TBST #9997 到 900 ml dH₂O 中。
8. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP rabbit, #8114; HRP mouse, #8125)。
9. TSA Plus Fluorescein kit (Akoya Biosciences, NEL741001KT)。
10. TSA Plus Cyanine 5 kit (Akoya Biosciences, NEL745001KT)。
11. TSA Plus Cyanine 3 kit (Akoya Biosciences, NEL744001KT)。
12. 剥离溶液： 10 mM 柠檬酸钠 (pH 6.0)
    1. 要配制 500 ml 10 mM 柠檬酸溶液：添加 50 ml SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) #14746 到 450 ml dH₂O 中。
13. ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961。

B. 实验步骤概述

涉及酪胺信号放大技术 (TSA) 的荧光 mIHC 是一项能在给定组织切片上，以逐步增加能量的方式同时检测多种目的蛋白的方法。其检测是通过涉及一抗和二抗的间接免疫荧光法促进信号放大来进行。

在下述实验步骤中，HRP 标记的二抗结合对靶标/目的抗原具有特异性的未标记一抗。最终检测到的荧光团标记酪胺分子可作为 HRP 的底物。激活的酪胺与目的蛋白上或周围的酪氨酸残基形成共价键，并永久性沉淀在抗原位点。这在维持抗原相关荧光信号的同时，可连续剥离一抗/二抗对，使得这个过程可以按顺序进行多轮染色。重要的是，这种方法的其中一个关键优势在于可以使用同一物种的多种一抗，而无需担心会发生交互作用。这可大大简化多重检测板设计过程。

C. 重要提示

影响酪胺的多重荧光 IHC 实验成功的因素有很多。

一抗浓度： 多重小图中每种一抗的最佳稀释度必须凭经验确定，并且通常可能与制造商建议的稀释度存在很大不同，因为酪胺沉淀会引起荧光信号扩增。我们强烈建议使用中等强度的荧光团对每种组分进行滴定，来优化多重检测板的个别组分。

顺序优化： 优化对组织切片应用多重小图中的抗体顺序，以确保多轮加热不会损坏靶标特异性表位，这点非常关键。我们建议使用中等强度的荧光团来检测多重检测板每个窄缝中的所有优化一抗，以确保荧光信号不受检测板内相对位置的影响。

抗体-荧光团配对： 通常，使用最亮的荧光团检测表达最低的靶标来配对抗体，这是一种很好的做法。我们建议检测由优化的一抗组成的基质和每种可用的荧光团，以获得检测板上每种靶标的最佳信号强度和信噪比。

D. 实验步骤

1. 烘干玻片（可选）
   1. 水平放置载玻片并在 60°C 下孵育 1.5 小时。
   2. 将载玻片从水平位置恢复到垂直位置，并在 60°C 下再孵育 30 分钟。

   注： 这个步骤允许固体石腊熔化。

2. 脱蜡/复水
   1. 孵育载玻片，在二甲苯中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   4. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

   注： 在室温下，轻轻搅动来完成所有洗涤过程。

3. 抗原修复

   注： 请参阅产品数据表，了解有关针对多重小图中每种一抗使用最佳修复液的建议。如果多重检测板包括一种建议与 EDTA 修复液搭配使用的抗体，则使用 EDTA 作为修复液。

   对于柠檬酸：

   1. 使用一个微波炉，并将载玻片放入 pH 6.0 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中煮沸。
   2. 在亚沸温度下保持 10 分钟。
   3. 将载玻片放置在台上，冷却到室温，持续 30 分钟。

   对于 EDTA：

   1. 使用一个微波炉，并将载玻片放入 1 mM EDTA 中煮沸，pH 8.0。
   2. 在亚沸温度下保持 15 分钟。无需冷却。
4. 猝灭
   1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
   2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
   3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
   4. 在 1X TBST 洗涤切片 5 分钟。
5. 染色/检测

   注： 可对组织切片进行单独预封闭，但没有必要。一抗的最佳稀释度必须凭经验确定。

   1. 在 SignalStain^® Antibody Diluent #8112 中稀释一抗。
   2. 向每个切片添加 100-400 μl 并在加湿箱中室温孵育 60 分钟。
   3. 在与一抗孵育期间，让 SignalStain^® Boost Detection Reagent (HRP rabbit, #8114 or HRP mouse, #8125) 平衡至室温。
   4. 清除抗体溶液，并用 1X TBST 洗涤切片 2 次，每次 3 分钟。
   5. 在组织切片上滴几滴 (100-400 μl) 对一抗种类具有特异性的 SignalStain^® Boost IHC detection Reagent (HRP rabbit, #8114 or HRP mouse, #8125)。
   6. 在加湿箱中室温孵育 30 分钟，避光保存。
   7. 用 1X TBST 洗涤载玻片 2 次，每次 3 分钟，轻轻搅动，并避光保存。
6. 酪胺信号放大技术 (TSA)

   注： 选择合适的荧光团偶联的 TSA Plus 扩增试剂时，考虑靶标表达水平和荧光团强度非常重要。一抗和荧光团的最佳配对应提前进行（参见上文的重要提示）。

   1. 按照制造商的建议稀释荧光团偶联的 TSA Plus 扩增试剂。
   2. 每块载玻片使用 100-400 μl，并在加湿箱中室温孵育 10 分钟，避光保存。
   3. 用 1X TBST 洗涤载玻片 2 次，每次 3 分钟，轻轻搅动，并避光保存。
7. 连续染色
   1. 如果进行多重染色（要检测多个目的靶标）：
      1. 继续进行剥离 （步骤 8）。
   2. 如果已完成多重检测板染色或正在进行单重检测（已检测到一个目的靶标）：
      1. 继续进行封片 （步骤 9）。
8. 剥离
   1. 使用一个微波炉，并将载玻片放入 pH 6.0 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中煮沸。
   2. 在亚沸温度下保持 10 分钟。

   3. 将载玻片放置在台上，冷却到室温，持续 30 分钟。

      继续使用不同的酪胺-荧光团偶联物进行 染色/检测（步骤 5）。

9. 封片

   使用 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 对切片进行封盖。

   注： 如果玻片用于创建波谱库的目的，则应使用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071。