血液中胞内蛋白和细胞表面标记物共染色实验步骤

重要事项：请参阅产品数据表首页或产品网页上的应用版块，以确定该产品是否已经验证且可用于流式细胞术 (F)。该实验步骤为全血联合染色的一种通用方法，但 CST 并没有使用所有可用于流式细胞术的抗体进行此实验步骤。请参阅产品网页上的产品专用流式细胞术实验步骤，以了解相应的固定和通透条件以及建议的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS) (#9808)： 配制 1 L 的 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中，混合均匀。
2. 16% 甲醛（无甲醇）。
3. Triton X-100：要制备 50 ml 0.1% Triton X-100，需向 50 ml 1X PBS 中加入 50 μl Triton X-100，并混匀。
4. 50% 甲醇。
5. 孵育缓冲液：在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998)。4°C 保存。
6. 二抗：抗小鼠 (#4408, #8890, #4410, #8887)，抗兔 (#4412, #8889, #4414, #8885)，抗大鼠 (#4416, #4418)。

B. 准备好全血（固定、裂解并通透），进行免疫染色

1. 在每个测试管中分装 100 μl 的新鲜全血。
2. 可选择：将试管置于架上并进行 37°C 水浴，以便于使用配体、抑制剂、药品等进行短期处理。
3. 在每个试管中添加 65 μl 的 10% 甲醛。
4. 短暂涡旋振荡后室温静置 15 分钟。
5. 在每个试管中添加 1 ml 0.1% Triton X-100。
6. 涡旋振荡后室温静置 30 分钟。
7. 添加 1 ml 的孵育缓冲液。
8. 离心使细胞沉淀，并吸干上清。
9. 重复步骤 7 和 8。
10. 使用PBS稀释的冰冷的 50% 甲醇溶液重悬细胞（使用前，甲醇溶液应储存于 -20°C 温度下）。
11. 冰上孵育至少 10 分钟。
12. 继续进行染色操作或将细胞储存于 -20°C 的 50% 甲醇溶液中。

C. 使用未标记的一抗或接合后的二抗进行染色

注：对于单克隆抗体，使用同型匹配的对照组；对于多克隆抗体，使用物种匹配的 IgG。

1. 添加 2–3 ml 孵育缓冲液到每个管中，通过离心进行洗涤。重复。
2. 添加一抗，一抗请按照数据表上或产品网页中推荐的稀释比例在孵育缓冲液中稀释。
3. 室温孵育 30–60 分钟。
4. 在 2–3 ml 的孵育缓冲液中离心，洗涤细胞。如果使用直接标记的抗体，则跳到步骤 8。
5. 按照生产商说明书推荐的稀释比例，在孵育缓冲液中，稀释荧光素标记的二抗，并用该二抗重悬细胞。
6. 室温孵育 30 分钟。
7. 在 2–3 ml 的孵育缓冲液中离心，洗涤细胞。
8. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞，并用流式细胞术进行分析。

参考文献：Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV (2005) Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A 67(1), 4–17.