免疫组化 (IHC) 实验的目标是在组织中可视化您所关注的靶标，同时维持组织架构的空间环境。可以通过肉眼（这是最常见的方式）或使用软件对 IHC 结果进行分析。
根据抗体检测，可使用光学或荧光显微镜可视化 IHC 样本。
对于荧光显微镜，如果需要额外的细节，可以使用共聚焦或多光谱成像系统。对于较小的抗体组合（1-3 个靶标），传统像机能够提供强大的图像。较大的组合（> 4 个靶标）则需使用多谱段相机。多谱段显影系统支持能够线性分离具有重叠激发/发射光谱的荧光基团（和色素原）的软件，因此能够以较高的分辨率促进多重靶标检测。
参见下文中使用多谱段相机和传统相机所拍的宽视野图像的比较。
PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Panel #65713: 使用 PD-L1 (E1L3N®) XP®Rabbit mAb #13684（绿色）、CD3ε (D7A6E™) XP®Rabbit mAb #85061 （黄色）和 CD8α (C8/144B) Mouse mAb (IHC Specific) #70306（红色），对石蜡包埋的人乳腺癌细胞进行的三重荧光 mIHC 分析。蓝色伪彩 = DAPI #8961（DNA 荧光染料）。
在免疫组织化学分析中，确定靶标特异性需要多个验证步骤。CST 的科学家们视情况使用各种方法来验证每种建议的 IHC 抗体，可确保您所观察的染色均具有特异性。
应考虑的几个变量是信号强度、背景和适当的定位。结合起来，这些是揭示阳性或阴性评估结果的指标。
有关 CST 如何确保使用我们的 IHC 抗体染色是正确和特异性的详细信息，请点击这里。
存在一些变量，包括从样品存储到试剂质量，它们可能影响您的 IHC 实验的信号强度和背景。
对于您的 IHC，需要经过验证的强效特异性一抗是不言而喻的。然而，您在一抗之外选择的试剂也可能对 IHC 实验中的信号强度产生显著影响。确保您使用来自 IHC 抗体专属实验步骤中的推荐稀释比例和试剂，SignalStain® Antibody Diluent #8112、SignalStain® Boost Detection Reagents、HRP for rabbit #8114 或 mouse #8125 和 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 能提高您的测定法的信号强度。
除了产生强大信号，减少背景染色也很重要。使用基于聚合物的检测试剂，例如 SignalStain® Boost Detection Reagents、HRP for rabbit #8114 或 mouse #8125 可显著减少内源性生物素的背景染色，从而改善您的结果。此外，在与一抗孵育前用含有 5% Normal Goat Serum #5425 的 1X TBST #9997 适当封闭 30 分钟可能很关键。
PLK1 (208G4) Rabbit mAb #4513: 如图所示，使用 # 4513 采用逐步试剂替代对石蜡包埋的人结肠癌进行的 IHC 分析，显示这些试剂可以区分染色不佳和可发表的结果。
IHC 分析的主要优势之一是能够看到您的靶标，同时保持组织的空间环境，包括在适当细胞类型或亚细胞区室中的定位。
确保染色定位适当是 CST 进行 IHC 抗体验证的一个重要方面，在任何 IHC 实验中都应如此。诸如 The Human Protein Atlas 等资源和如 RAN 数据等正交方法在正确定位未知的情况下可能有帮助。
对阳性或阴性结果进行有信心的评估需要对您的染色信息进行综合 - 如信号强度、背景和定位。评估染色试剂和方法性能的另一个宝贵资源是使用 IHC 对照切片。
这些对照切片含有福尔马林固定、石蜡包埋的细胞沉淀物，可作为免疫组织化学实验步骤的对照。每块切片含有阴性和阳性沉淀物，每组有 5 块玻片。
若要浏览可从 CST 获取的 IHC 对照切片，请点击这里。